СВЯЗЬ ГОМОЛОГИИ MSH3 и ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ РЕКОМБИНАЦИИ с САЙТОМ РАСЩЕПЛЕНИЯ ФУРИНОМ SARS-CoV-2.

Введение:

Основываясь на недавней публикации, описывающей инсерционные варианты SARS-CoV-2 ( 1 ), мы хотели бы обратить внимание на наши недавние результаты, связанные с последовательностью сайта расщепления фурином FCS (сайт расщепления фурином) в спайке SARS-CoV-2 (S). белок. SARS-CoV-2, вызывающий пандемию COVID-19 ( 2) имеет 82,3% идентичность аминокислот с коронавирусом летучих мышей SL-CoVZC45, 77,2% идентичность аминокислот с SARS-CoV и 96,2% идентичность последовательности генома с коронавирусом летучих мышей RaTG13. Хотя между SARS-CoV-2 и RaTG13 существует множество различий в точечных мутациях, только одна вставка и несходство превышают 3 нуклеотида (нт): 12-нуклеотидная вставка, кодирующая четыре аминокислоты (аминокислоты 681-684, PRRA) в SARS-CoV Открыт белок -2S. Эта многоосновная FCS отличает SARS-CoV-2 от других бета-коронавирусов линии В или любого другого сарбековируса ( 3 ). Добавление FCS повысило инфекционность SARS Co-V-2 в 2019 году ( 4 ). Отсутствие этой FCS приводит к аттенуированным вариантам SARS-CoV-2, пригодным для вакцинации животных, что подчёркивает его актуальность для инфекции человека ( 5 ).). Этот FCS (сайт расщепления фурином) жизненно важен для передачи вируса человеку и хорьку ( 6 ), расширяет тропность вируса к клеткам человека ( 7 ) и необходим для тяжёлого заболевания в двух животных моделях SARS-CoV-2 ( 8 ).

Спайковый белок SARS-CoV-2 и MSH3.

Особенностью нуклеотидной последовательности, кодирующей сайт расщепления фурином PRRA в S-белке SARS-CoV-2, являются два последовательных кодона CGG. Этот кодон аргинина редко встречается у коронавирусов: относительное использование синонимичных кодонов (RSCU) CGG в CoV панголина составляет 0, в CoV летучих мышей 0,08, в SARS-CoV 0,19, в MERS-CoV 0,25 и в SARS-CoV-2 0,299 ( 9 ). ).

Поиск 12-нуклеотидной вставки с помощью BLAST привел нас к 100% обратному совпадению в запатентованной последовательности (SEQ ID11652, нуклеотиды 2751-2733), обнаруженной в патенте США 9 587 003, поданном 4 февраля 2016 г. ( 10 ) ( рис. 1 ) . Изучение SEQ ID11652 показало, что совпадение распространяется за пределы 12-нуклеотидной вставки на 19-нуклеотидную последовательность: 5′-CTACGTGCCCGCCGAGGAG-3′ (нуклеотиды 2733-2751 SEQ ID11652), так что полученная мРНК будет иметь 3′-GAUGCACGGGCGGCUCCUC -5′ или эквивалентно 5′- CU CCU CGG CGG GCA CGU AG-3′ (нуклеотиды 23547-23565 в геноме SARS-CoV-2, в котором четыре выделенных жирным шрифтом кодона дают PRRA, аминокислоты 681–684 его шипа белок). Это очень редко встречается в базе данных NCBI BLAST.

Корреляция между этой последовательностью SARS-CoV-2 и обратным дополнением запатентованной последовательности мРНК имеет неопределенное происхождение. Обычный биостатистический анализ показывает, что вероятность случайного присутствия этой последовательности в вирусном геноме из 30 000 нуклеотидов составляет 3,21 × 10 ^-11 ( рис. 2 ).

Запатентованная последовательность SEQ ID11652, прочитанная в прямом направлении, кодирует 100% совпадение аминокислот с гомологом 3 мутации S человека (MSH3) ( 9 ). Ген MSH3 представляет собой белок репарации несоответствия ДНК (часть бета-комплекса MutS) ( 11 ). SEQ ID11652 транскрибируется в мРНК MSH3, кодоны которой оптимизированы для человека ( 12 ). Мы не нашли 19-нуклеотидную последовательность CTCCTCGGCGGGCACGTAG ни в одном эукариотическом или вирусном геноме, кроме SARS-CoV-2, со 100% охватом и идентичностью в базе данных BLAST ( дополнительные таблицы 1–3 ) .

Обсуждение.

Замена MSH3 кодон-оптимизированной последовательностью мРНК для экспрессии у человека, вероятно, имеет применение при раке с дефицитом репарации несоответствия. Хотя часть обратной комплементарной последовательности, присутствующая в SARS-CoV-2, может быть случайным совпадением, другие возможности заслуживают рассмотрения.

Известно, что избыточная экспрессия MSH3 препятствует репарации несоответствия (секвестрация MSH2 из комплекса MutS alpha, включающего MSH2 и MSH6, приводит к деградации MSH6 и истощению MutS alpha) ( 13 ), что имеет вирусологическое значение. Индукция дефицита репарации несоответствия ДНК приводит к восприимчивости вируса гриппа А (IAV) к респираторным клеткам человека и повышенной патогенности ( 14 ). Дефицит восстановления несоответствия может продлить выделение SARS-CoV-2 ( 15 , 16 ).

Отсутствие CTCCTCGGCGGGCACGTAG в любом эукариотическом или вирусном геноме в базе данных BLAST делает рекомбинацию в промежуточном хозяине маловероятным объяснением его присутствия в SARS-CoV-2. мРНК с оптимизированным кодоном человека, кодирующая белок, на 100% гомологичный человеческому MSH3, может в ходе вирусных исследований непреднамеренно или преднамеренно вызывать дефицит репарации несоответствия в клеточной линии человека, что может повысить восприимчивость к SARS-подобной вирусной инфекции. Инфицирование клеток человека, трансдуцированных SEQ ID11652-ген MSH3, SARS-подобным вирусом может активировать рекомбинацию выбора копии ( 15 ). Репликация SARS-CoV-2 и других одноцепочечных РНК—вирусов с геномом РНК положительной полярности инициируется синтезом РНК с отрицательной цепью в цитоплазме инфицированных клеток ( 17 ) (Рисунок 1 ). РНК с отрицательной цепью является матрицей для синтеза РНК с положительной цепью, используемой для трансляции неструктурных белков, комплекса репликации и транскрипции или новых капсидов вириона. Коронавирусы генерируют двухцепочечную РНК на ранней стадии инфекции посредством геномной репликации и транскрипции мРНК ( 18 ).

Приобретение последовательности сайт расщепления фурином с обратным комплементом из сверхэкспрессированной мРНК MSH3 с положительным смыслом может происходить путём рекомбинации выбора копии с промежуточным продуктом РНК SARS-CoV-2 с отрицательным смыслом ( 15 ), включая переход с одной матрицы на другую ( 19 ) ( рис. 1 ). Гомология между SARS-CoV-2 и другими известными коронавирусами прекращена, и большинство последовательностей SARS-CoV-2 происходят от относительно недавнего общего предка с летучей мышью RaTG13. Более того, графики сходства (SimPlots) выявили внезапные изменения идентичности последовательностей между SARS-CoV-2 и RaTG13, сигнализируя о потенциальных событиях рекомбинации, что может объяснить способность SARS-CoV-2 связываться с ACE2 через его RBD, что не является чехлом для RBD RaTG13 ( 15 ).

Критика этой гипотезы заключается в том, что идентифицированная последовательность находится на противоположной цепи открытой рамки считывания в SEQ ID11652. Однако клетки, трансфицированные MSH3, которые индуцируют дефицит репарации несовпадений, могли нацеливаться на двухцепочечную кДНК, кодирующую SEQ ID11652. Такие клетки, совместно трансфицированные SARS-подобным вирусом, экспрессирующим RdRp, могут присоединяться к этой 19-нуклеотидной последовательности ( 15 ) и обеспечивать интеграцию фрагмента из отрицательной цепи в вирусный геном, включая FCS, несмотря на то, что он находится на противоположной цепи открытая рамка считывания. Механизмы репарации несоответствия позволили интегрировать короткие фрагменты антисмысловых цепей в экспериментальные модели ( 20 , 21 ).). Микрогомология может направлять рекомбинацию между MSH3 и SARS-подобным вирусом, которая может происходить в интересующей 19-нуклеотидной последовательности.

Присутствие в SARS-CoV-2 последовательности РНК из 19 нуклеотидов, кодирующей FCS на аминокислоте 681 его шиповидного белка со 100% идентичностью с обратным комплементом запатентованной последовательности мРНК MSH3, является весьма необычным. Возможные объяснения этой корреляции должны быть дополнительно исследованы.

В этом исследовании были проанализированы общедоступные наборы данных. Эти данные можно найти здесь: SEQ ID11652.